簡(jiǎn)介

精密醫(yī)學(xué)，特別是醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)，已經(jīng)顯著啟用，并加快了步伐，以液體活檢為基礎(chǔ)的診斷的出現(xiàn)。雖然針對(duì)循環(huán)無(wú)細(xì)胞DNA（cfDNA）的液體活檢分析提供了有用的診斷信息，如突變負(fù)擔(dān)，但由于從垂死的細(xì)胞中衍生出cfDNA，這些檢測(cè)僅限于對(duì)疾病狀態(tài)的靜態(tài)評(píng)估。利用循環(huán)細(xì)胞外囊泡（EV）和EV相關(guān)貨物（如無(wú)細(xì)胞RNA（cfRNA））的檢測(cè)，這些分析物從活細(xì)胞和垂死的細(xì)胞中產(chǎn)生，為疾病提供了全面和動(dòng)態(tài)的視圖。使用 EV 和 cfRNA 進(jìn)行液體活檢測(cè)試的一個(gè)重要障礙是捐贈(zèng)者標(biāo)本的完整性。采集的患者血液樣本經(jīng)過(guò)時(shí)間依賴性降解，導(dǎo)致疾病非特異性 EV 和 cfRNA 增加，從而降低分析素測(cè)量的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。為了克服這個(gè)脆弱性，我們開發(fā)了Streck RNA完整BCT（RNAC），這是其血液采集管，用于穩(wěn)定細(xì)胞外囊泡和無(wú)細(xì)胞RNA的繪制時(shí)間濃度。樣品完整性將有利于有興趣直接分析EV組和間接分析cfRNA通過(guò)RT-PCR或下一代基于測(cè)序的方法。將此收集管納入預(yù)分析工作流程將允許長(zhǎng)途運(yùn)輸、批量和/或延遲樣品處理，而對(duì)樣品完整性或下游分析產(chǎn)生影響。

材料與方法

血漿樣本制備：根據(jù) IRB（內(nèi)奧馬哈克里頓大學(xué)），通過(guò)病毒#830575從健康獻(xiàn)血者那里采集血液樣本。等離子體使用一般雙旋協(xié)議（1800 g x 15min 和 2800 g x 15 分鐘）進(jìn)行隔離，并在 -80 oC 下冷凍，直到使用。

EV分析：使用NanoSight NS300儀器（馬爾文潘納利科有限公司）對(duì)EV濃度和顆粒尺寸進(jìn)行檢測(cè)。冷凍血漿樣品迅速解凍，在PBS中稀釋1：50-1：500，并根據(jù)制造商的建議進(jìn)行測(cè)定。

cfRNA分離和分析：血漿樣品被迅速解凍，總核酸被分離使用QIAamp循環(huán)核酸套件根據(jù)制造商的建議miRNA協(xié)議（Qiagen公司）。樣品解，從30分鐘增加到60分鐘。結(jié)轉(zhuǎn)DNA耗盡，cfRNA使用無(wú)RNaseDNase集和RNeasy MinElute清理套件（均來(lái)自奇根）進(jìn)行濃縮。無(wú)細(xì)胞RNA分析使用2100生物分析器與RNA 6000筆克套件（安捷倫技術(shù)公司，美國(guó)圣克拉拉）和Qubit RNA HS測(cè)定試劑盒（塞默-菲舍爾），都根據(jù)制造商的建議。

RNA-seq： 無(wú)細(xì)胞RNA使用NEBNext rRNA消耗試劑盒耗盡rRNA，然后使用NEBNext超II定向RNA庫(kù)制備試劑盒進(jìn)行測(cè)序，兩者均根據(jù)所提供的說(shuō)明。庫(kù)被量化（NEBNext 庫(kù)量化套件，用于照明）和大小使用在 4200 磁帶站系統(tǒng) （Agilent） 上運(yùn)行的高靈敏度 D1000 屏幕磁帶確定。使用高輸出 v2.5 測(cè)序套件（Illumina，圣地亞哥，加利福尼亞州）在 Illumina NextSeq 550 上對(duì)庫(kù)進(jìn)行池化和排序。所有數(shù)據(jù)都已輸出并保存到基于云的 BaseSpace 服務(wù)器 （Illumina）。讀取與人類基因組對(duì)齊，并分別使用 BaseSpace 應(yīng)用程序 Top-Hat 對(duì)齊和 DESeq2 完成差異表達(dá)式。

結(jié)果

細(xì)胞外囊泡的繪制時(shí)間濃度的維持

圖1.在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存時(shí)，RNAC 樣品中保持細(xì)胞外囊泡的濃度長(zhǎng)達(dá) 7 天。9 個(gè)不同的捐贈(zèng)者被吸引到 EDTA 和 RNAC BCT 中，等離子體被立即隔離（繪制時(shí)間）或 2 天、4 天和 7 天后環(huán)境條件存儲(chǔ)。在此期間，平均整體顆粒大小保持不變（未顯示數(shù)據(jù)）。（配對(duì)樣品 t 檢驗(yàn)，ns = 不顯著，**= p≤0.01）。

cfRNA 濃度在 RNAC 中保持長(zhǎng)達(dá) 7 天

圖2。A.無(wú)細(xì)胞RNA濃度在RNAC中保持7天，當(dāng)儲(chǔ)存在環(huán)境溫度（Qubit測(cè)定，n=6健康捐贈(zèng)者）。B.從單個(gè)供體中分離出的 cfRNA 的生物分析器痕跡表明，在繪制到 EDTA BCTs 的血液中，小RNA物種的時(shí)間依賴性增加。 第 3 天和第 7 天 cfRNA 濃度維持在接近繪制時(shí)間水平，以接近繪制到 RNAC 的同一供體的時(shí)間水平。

測(cè)序庫(kù)產(chǎn)量在 RNAC Out 中保存到 7 天（環(huán)境存儲(chǔ)）

圖3。A.總體測(cè)序庫(kù)產(chǎn)量與無(wú)細(xì)胞RNA的輸入量直接相關(guān)。雖然無(wú)細(xì)胞RNA水平隨著EDTA樣品環(huán)境條件儲(chǔ)存時(shí)間的變化而增加，但總體庫(kù)產(chǎn)量也增加。被吸引到 RNAC BCT 中的相同捐贈(zèng)者保持庫(kù)產(chǎn)量以繪制時(shí)間水平（配對(duì)樣本 t 檢驗(yàn)，ns = 不顯著，**= p < 0.01，n=9 捐贈(zèng)者）。B.相對(duì)測(cè)序庫(kù)大小和產(chǎn)量為代表性的健康捐贈(zèng)者（復(fù)合凝膠圖像顯示預(yù)期的+350nt片段大小每個(gè)庫(kù)（紅色箭頭），這在EDTA增加，但保持基線水平在RNC）。C.單個(gè)庫(kù)的腳本覆蓋率在 EDTA 和 RNAC 樣本之間類似，并且在 7 天環(huán)境條件存儲(chǔ)過(guò)程中不會(huì)改變。D.與編碼序列對(duì)齊的映射讀取與繪制到 EDTA BCTs 的血液樣本中的時(shí)間減少，并在繪制到 RNAC 中的相同供體中保持不變（從 9 個(gè)供者集的平均讀取數(shù)）保持不變。

RNAC 中繪制時(shí)間等離子轉(zhuǎn)錄組維護(hù)

圖4。在RNAC中，大于對(duì)數(shù)2倍的基因表達(dá)變化小化 —— 只有8個(gè)基因表現(xiàn)出變化，而EDTA BCTs（n=5捐贈(zèng)者）中只有928個(gè)基因表現(xiàn)出變化。重要的是，在環(huán)境條件存儲(chǔ)的 7 天中，非常豐富的成績(jī)單（即規(guī)范化平均計(jì)數(shù)較高的成績(jī)單）保持在接近基線水平。

結(jié)論

• Streck RNA 完整 BCT 保持血漿細(xì)胞外囊泡的繪制時(shí)間濃度長(zhǎng)達(dá) 7 天，當(dāng)血液在環(huán)境條件下儲(chǔ)存。
• 從RNA分離出的血漿無(wú)細(xì)胞RNA完整BCT可用于通用RNA-seq工作流程，主要參數(shù)（轉(zhuǎn)錄覆蓋率、映射讀取、繪制時(shí)間血漿轉(zhuǎn)錄組）在抽血后立即與金標(biāo)準(zhǔn)EDTA BCT不一樣。
• RNA完整BCT保持cfRNA的繪制時(shí)間水平，從而在血液儲(chǔ)存環(huán)境條件下時(shí)，可獲得長(zhǎng)達(dá)7天的測(cè)序庫(kù)產(chǎn)量。
• 血漿轉(zhuǎn)錄組維持在Streck RNA完成BCT到7天環(huán)境條件存儲(chǔ)。

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